ردیابی عوامل باکتریایی سوختگی برگی لوبیا در استان های لرستان، مرکزی و همدان

لوبیا به دلیل داشتن مقادیر بالای پروتیئن و انرژی، بعد از غلات و سیب زمینی از مهمترین محصولات کشاورزی به حساب می آید. بیماری های باکتریایی نظیر سوختگی معمولی لوبیاxanthomonas axonopodis pv. phaseoli))،سوختگی هاله دار لوبیا (pseudomonas savastonoi pv. phaseolicola) و پژمردگی باکتریایی لوبیا (curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccufmaciens) از عوامل محدود کننده تولید این محصول در بسیاری از مناطق کشت لوبیا در دنیا می باشند. در سالهای اخیر، بیماریهای لکه برگی و پژمردگی در مزارع لوبیای استان های لرستان و مرکزی، خسارات زیادی را به این محصول وارد کرده است که به ظن باکتریایی بودن، تشخیص عوامل ایجاد کننده این بیماری ها ضروری بود. جهت تعیین عوامل بیمارگر باکتریایی احتمالی در این مزارع، از گیاهان لوبیای واجد علایم لکه برگی و پژمردگی درمزارع مختلف استانهای مزبور نمونه برداری شد. از کشت نمونه های مزبور در محیط های کشت عمومی و اختصاصی57 جدایه باکتریایی به دست آمد. جدایه های مزبور با توجه به خصوصیات مورفولوژیکی، سرولوژیکی و مولکولی در سه گروه قرار متفاوت گرفتند. جدایه های باکتریایی گروه i گرم منفی بوده وکلنی های زرد شفاف مایل به لیمویی داشتند که بر اساس خصوصیات بیماری زایی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی xanthomonas axonopodis pv. phaseoli(xap)تشخیص داده شدند. این جدایه ها با جفت آغازگر اختصاصی x4c-f/x4e-rدر واکنش pcrیک باندbp730 مربوط به xap را تکثیر نمودند. به دلیل ناتوانی در تولید رنگدانه ملانین در محیط کشت و نیز عدم تکثیر باند bp450 با جفت آغازگر اختصاصی xf1/xf2، هیچ کدام از این جدایه ها xanthomonas fuscans subsp. fuscans، تشخیص داده نشدند. جدایه های باکتریایی گروه ii گرم مثبت بوده و روی محیط آگار غذایی (na) کلنی های زرد مایل به کرم و یا صورتی داشتند. با انجام آزمون- های بیماری زایی و بیوشیمیایی جدایه های گروهii، تعلق این جدایه ها به باکتری(cff) curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccufmaciens عامل پژمردگی باکتریایی لوبیا معلوم گردید. همچنین، این جدایه ها در واکنش pcr با جفت آغازگر اختصاصیcff-for2/cff-rev4، یک باند bp306 تکثیر نمودند. توالی یابی نوکلئوتیدی این باند و همردیف سازی آن با توالی های موجود در بانک ژن، شباهت 97 درصدی توالی این جدایه ها با جدایه های cff موجود بانک ژن را مشخص کرد.جدایه های cff به دست آمده در این بررسی روی محیط nbyکلنی های زرد و صورتی کاروتنوئیدی داشتند. جدایه های باکتریایی موجود در گروه iii به واسطه گرم منفی بودن و تولید ماده فلئورسنت در محیط king’s b از بقیه مجزا شدند. پس از انجام آزمون های مختلف، بیشترین شباهت بیوشیمیایی برای یکی از جدایه ها با باکتری p.viridiflava به دست آمد و سایر جدایه ها نیز که توانایی بیماری زایی در غلاف و بوته لوبیا را نداشتند از دور آزمایشات حذف شدند. پس از تکثیر قسمتی از ناحیه 16s rdnaاین جدایه با جفت آغازگر ps-for/ps-rev و توالی یابی قطعه آن معلوم شد که این جدایه ها به لحاظ ترادف نوکلئوتیدی نیز با جدایه p.viridiflava مشابهت کامل دارد. پس از تایید وجود دو باکتری xapوcff به عنوان عوامل اصلی لکه برگی و پژمردگی در مزارع لوبیای استان های لرستان و مرکزی، به منظور به دست آوردن یک روش سریع، حساس و کم هزینه برای ردیابی همزمان دو باکتری در بذرهای آلوده، از روش multiplex pcr، با به کارگیری جفت آغازگرهای اختصاصی باکتری های xap(xf1/xf2) و cff-for2/cff-rev4) cff)، استفاده شد که به ترتیب منجر به تکثیر باندهای bp306 و bp730 گردید. به این ترتیب معلوم شد که multiplex pcr می تواند یک روش کارآمد، سریع و کم هزینه برای ردیابی همزمان باکتری های cffو xap در بذر لوبیای آلوده باشد.